El origen de la división de ambos territorios se debe a las capitulaciones de Carlos V, revisadas en 1534, que asignaban a Pizarro doscientos sesenta leguas desde Tumbes al sur, y otras doscientos a Diego de Almagro al sur de éstas. Juan de Saavedra, adelantado de Diego de Almagro, llegó en 1535 al Lago Titicaca y al valle de La Paz, para luego fundar las ciudades de Paria (Oruro) y Tupiza en 1536 al sur. Muerto Almagro, Francisco Pizarro envió a su hermano Gonzalo a colonizar la provincia del Collao. Pedro de Anzúrez fundó Chuquisaca (actual Sucre) en 1538, Potosí surgió en 1546, La Paz en 1548 y Cochabamba en 1574.
La corriente colonizadora del Río de La Plata se expandió hacia el territorio de lo que hoy en día es Bolivia, con la fundación de Santa Cruz en 1561. Un grupo de españoles partidos de Asunción del Paraguay y Buenos Aires encabezados por Ñuflo de Chávez y acompañados por aliados itatines conquistaron la región, los primeros fundaron Santa Cruz a orillas de la serranía de Sutó y los segundos se establecieron en el norte en la región hoy conocida como Guarayos. Esta ciudad de frontera se sirvió como marca española de contención a los constantes ataques de bandeirantes portugueses que desde la región de São Paulo invadían la región capturando indígenas para mano de obra en las colonias portuguesas, y el constante asecho de los guaraníes que atentaban contra la frontera sudeste de la región minera del Alto Perú.
El clima subtropical continental, la carencia de mano de obra indígena abundante, la ausencia de minas y grandes riquezas, y el constante ataque de los guaraníes hicieron que Santa Cruz sea de poco interés para la migración española. Para contrarrestar esto y asegurase que esta región aislada se pueble de fieles a la corona, se libró impuesto a sus habitantes, se dio indulto a grupos perseguidos (principalmente judíos conversos, pero también algunos cimarrones, gitanos y mercenarios), además se dio libertad y encomiendas a favor de mestizos e inclusive indígenas lo cual no estaba permitido en otras regiones de la colonia. Santa Cruz se mantuvo como una cultura agrícola ganadera aislada del auge minero del Alto Perú, pero creció en población y sus habitantes fundaron otros pueblos y ciudades importantes en toda la planicie Chaco-Beniana y los valles del sudoeste (Vallegrande, Portachuelo, Trinidad, Charagua, Cuevo, Samaipata, San Ignacio, Riberalta y otros).
Por su parte, el Alto Perú se caracterizó por presentar una base minero-agrícola. La ciudad de Potosí, la más poblada de América en 1574 (120.000 habitantes), se convirtió en un gran centro minero por la explotación de las minas de plata del Cerro Rico de Potosí y en 1611 era la mayor productora de plata del mundo. El rey Carlos I había otorgado a esta ciudad el título de villa imperial después de su fundación.
Como un colchón adicional de presencia española ante la avanzada portuguesa, la corona permitió el establecimiento de misiones jesuíticas al norte y este de Santa Cruz en las regiones de Moxos y Chiquitos. Estas misiones fueron muy exitosas y se establecieron centros importantes y avanzados tanto cultural como económicamente.
Estos territorios pertenecían a la gobernación de Santa Cruz y los misioneros eran en su mayoría originarios del centro de Europa (Suiza, Alemania, Hungría).
Como testigos del nivel de desarrollo de estos centros misionales quedan las Misiones de Chiquitos (San Javier, Concepción, San Miguel, San Rafael, San José y Santa Ana) todas en Santa Cruz y fueron declaradas Patrimonio de la Humanidad por Unesco.
Como testigos del nivel de desarrollo de estos centros misionales quedan las Misiones de Chiquitos (San Javier, Concepción, San Miguel, San Rafael, San José y Santa Ana) todas en Santa Cruz y fueron declaradas Patrimonio de la Humanidad por Unesco.
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